ALS相关SOD1突变体的自噬性降解及Gemin3作为ALS相关FUS蛋白的结合蛋白的鉴定

【摘要】肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种由运动神经元死亡引起的,成年发作的,致命的神经退行性疾病。绝大多数ALS病例为发病原因不明的散发性ALS(sALS),其余约10%具有家族史,称为家族性ALS(fALS)。目前已经发现了多种家族性ALS致病基因,SOD1(铜锌超氧化物歧化酶)和FUS(fusedinsarcoma)是其中的两种。为了了解ALS的发生机制,并最终为ALS的治疗提供新途径,本实验研究了SOD1的自噬降解途径；鉴定了一种新型的FUS结合蛋白。(1)ALS相关的SOD1突变体的自噬性降解SOD1是最早发现的ALS致病基因,约占家族性ALS病例的20%。SOD1突变体对运动神经元的损伤不是功能缺失而是获得性毒性引起的。因此,了解SOD1突变体的降解清除途径可以为ALS的发生及治疗提供新的线索。通过比较野生型SOD1和ALS相关SOD1突变体(A4V,G93A)在细胞内的表达,发现SOD1突变体的表达水平较野生型明显下降,并且形成大的聚集体,表现出明显的去垢剂不溶性。研究证明多种神经退行性疾病致病蛋白通过自噬途径降解。为了验证ALS相关的SOD1突变体是否通过该途径降解,利用多种自噬调节剂,如rapamycin抑制mTOR诱导自噬发生,Beclinl通过与PI3KⅢ(也称为hVps34)结合增强其激酶活性诱导自噬起始,3-MA抑制PI3KⅢ活性从而抑制自噬小体的形成,BafilomycinAl和NH4C1抑制自噬小体和溶酶体的融合,E64d和pepstatinA抑制溶酶体中组织蛋白酶活性等调控自噬过程,结果显示诱导自噬可以促进SOD1的降解,而抑制自噬则导致SOD1发生堆积。此外,利用一种pH敏感的双荧光标签发现SOD1突变体可以被包裹进自噬溶酶体中。因此,ALS相关SOD1突变体经自噬途径降解。(2)SOD1G93A突变体对自噬活性的影响作为机体在病理条件下清除异常蛋白的一种潜在机制,自噬可以被多种聚集体蛋白活化。通过检测不同发病阶段的ALS小鼠体内的自噬小体标记物LC3Ⅱ的表达水平,发现其在发病末期(125d)较对照组显著升高。细胞模型中,利用BafilomycinA1抑制自噬小体-溶酶体融合,发现SOD1G93A突变体可以提高内源性LC3Ⅱ的水平,促进共转染的EGFP-LC3Ⅰ向EGFP-LC3Ⅱ转化,提示在细胞模型中SOD1突变体可以诱导自噬小体的形成。为了探讨其可能的机制,检测了SOD1G93A对自噬起始关键因子Beclinl与其结合蛋白(ATG14L、Rubicon及UVRAG)结合能力的影响。结果显示,与野生型对照组相比,SOD1G93A对ATG14L,Rubicon和UVRAG与Beclin1的结合能力无明显影响,说明SOD1G93A可能通过其它途径影响了自噬的发生。(3)Gemin3作为ALS相关FUS蛋白的结合蛋白的鉴定FUS是最近发现的一种新型ALS致病蛋白。作为一种RNA/DNA结合蛋白,FUS参与mRNA转录,剪接,运输及成熟等过程。因此,FUS突变引起的RNA代谢异常可能在ALS的发生过程中起关键作用,但目前对其致病机制的了解还很有限。为了揭示FUS突变体可能的致病机制,利用质谱蛋白组学的方法,发现了Gemin3(也称为DP103或DDX20),一种SMN复合体组分,是FUS的结合蛋白。GST-pulldown和Co-IP实验证实了野生型FUS和ALS相关的FUS突变体均可与Gemin3相互作用,且野生型与突变体之间没有明显差异。利用FUS和Gemin3的截断突变体发现FUS结合于Gemin3的C末端(438-824氨基酸),Gemin3结合于FUS的QSYG区(1-165氨基酸)。细胞中过表达FUS突变体使Gemin3形成与FUS聚集体共定位的大的细胞质斑点,抑制细胞核内Gem小体的形成,并且引起Gemin3在去垢剂不溶部分发生堆积。此外,FUS突变体可以下调细胞内UsnRNP的水平,引起E1A报告基因的剪接异常。因此,结果表明FUS突变体可能通过将Gemin3包裹进聚集体中引起UsnRNP功能缺陷,使随后的rnRNA前体剪接发生改变。总之,实验结果表明ALS相关的SOD1通过自噬途径降解,为开发自噬调控因子以清除体内的SOD1突变体作为ALS治疗的手段提供了依据；鉴定了FUS与Gemin3之间的相互作用,为FUS相关的ALS的发生的研究提供了线索。
【作者】魏砚明；
【导师】雷鸣；ZhuHaining；
【作者基本信息】西北农林科技大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】肌萎缩侧索硬化症(ALS)；铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)；自噬；FUS；Gemin3；

【参考文献】
[1]王金达.碳酸酐酶抑制剂甲苯磺烷唑胺非临床药代动力学特征[D].中国人民解放军军事医学科学院,药理学,2013,硕士.
[2]林卫通.流通信息化对流通产业发展的促进作用研究[D].南京财经大学,产业经济学,2012,硕士.
[3]P.Kennett,R.L.Ireson,肖玲.垂直地震剖面法——构造和地层分析的解释工具[J].石油地球物理勘探,1982,05:27-42.
[4]张凯,曹加恒,叶可,刘茂福.一个高效的图像库检索模型[J].计算机工程与应用,2002,03:145-146+224.
[5]于筱川.基于机器学习的车辆目标识别方法[D].西安电子科技大学,计算机应用技术,2009,硕士.
[6]冯昆山.营口市农业结构调整研究[D].中国农业科学院,农村与区域发展（专业学位）,2013,硕士.
[7]李依泽.糖原合成酶激酶-3β调控NMDA及AMPA受体在瑞芬太尼痛觉过敏中的机制研究[D].天津医科大学,麻醉学,2014,博士.
[8]冉东升.新媒体时代德尔惠公司整合营销传播策略研究[D].吉林大学,工商管理,2013,硕士.
[9]何金.大气压射频放电等离子体活性粒子演化特性的数值模拟研究[D].山东大学,高电压与绝缘技术,2013,硕士.
[10]张义芳.基于Android的SD卡测试系统的设计和实现[D].广东工业大学,电子与通信工程（专业学位）,2014,硕士.
[11]沈卓.地域文化视角下的餐饮空间设计研究[D].浙江工业大学,2013.
[12]张晓龙.辽宁联通BSS系统总体架构及计费账务系统的设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2014,硕士.
[13]罗筱.破碎、幻象与宿命[D].四川外国语大学,英语语言文学,2014,硕士.
[14]王峰.甘肃省产业结构优化与经济增长关系研究[D].兰州商学院,区域经济学,2013,硕士.
[15]姜飞荣.永磁同步电机伺服控制系统研究[D].浙江大学,2006.
[16]杨江娇.论消费者参与公司治理[D].山东大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[17]陈翔.微流路医学诊断芯片的制作及研究[D].中国科学院研究生院（电子学研究所）,2003.
[18]王虹.密闭鼓风炉探料控制系统设计及应用[J].冶金自动化,2011,06:67.
[19]张东妍.深圳市MSM人群HPV感染及高危行为的流行病学研究[D].北京协和医学院,皮肤病与性病学,2014,博士.
[20]卢晨,钟健雄,肖灿,卞军.价值方法的创新2012年价值管理国碌射义(IVMC2012)[J].价值工程,2014,23:2+330.
[21]江倩.不同种类柑橘果实香气物质组成差异及其特征性组分鉴别[D].浙江大学,果树学,2013,硕士.
[22]邱耀.蓝色经济区产业布局和资源整合研究[D].山东大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[23]张晓飞.制造型企业系统化管理体系研究[D].天津财经学院,企业管理,2004,硕士.
[24]赵冬梅.斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）hepcidin抗菌肽的基因工程制备[D].上海海洋大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[25]王巧.国检分支局服务质量评价指标体系构建及应用[D].南京理工大学,工业工程,2012,硕士.
[26]张金.人类活动对农业土壤中氮的影响[D].兰州大学,水文学及水资源,2013,硕士.
[27]马云岗.小型油动直升机的自动驾驶仪设计[D].西安电子科技大学,光学工程,2012,硕士.
[28]张红莲.隐私权的保护与限制[D].华中师范大学,民商法学,2013,硕士.
[29]赵南.石墨烯及纳米银/石墨烯复合（超）薄膜的制备及拉曼增强性能研究[D].江苏大学,2014.
[30]郑大鹏.整体政府视角下的政府服务热线建设研究[D].吉林大学,行政管理,2014,硕士.
[31]张兆云,刘宏君.数字化变电站光纤差动保护同步新方法[J].电力系统自动化,2010,22:90-92.
[32]辛一凡.于右任教育思想与实践研究[D].延安大学,中国近现代史,2014,硕士.
[33]唐春蓉.一株75℃驱油菌的筛选及性能评价[D].成都理工大学,生物工程,2013,硕士.
[34]夏玮.民航事故分析决策支持系统的研究与实现[D].辽宁工程技术大学,管理科学与工程,2004,硕士.
[35]余顺铨.氟原子对聚合物光伏给体材料性能的影响[D].北京化工大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[36]张敏建.宝钢一炼钢三电系统不停产改造[J].冶金自动化,2004,06:43-46.
[37]汪勇,杨海琴,张瑞军.基于强基因模式组织算法的VRPTW研究[J].控制与决策,2011,04:606-610.
[38]马亚伦　王本伦樊文伟.潜江国际甲壳素会议成果丰硕[N].湖北日报,2010-11-09015.
[39]王旭东.臭氧氧化对城市二级出水分子量分布及膜阻力构成的影响研究[D].西安建筑科技大学,环境工程,2004,硕士.
[40]经敬楠.BNi-7钎料真空钎焊纯Fe、纯Ni、纯Mo、纯Cr及扩散行为研究[D].上海工程技术大学,材料加工工程,2012,硕士.
[41]王雪君.临床医务人员工作满意度调查分析[D].长安大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[42]卜荣丽.几类分数微分方程解存在性和唯一性的研究[D].武汉科技大学,应用数学,2012,硕士.
[43]袁俊.NMD系统第四次导弹拦截试验成功[J].飞航导弹.2001(11)
[44]张志友.基于LIDAR数据和航空影像的地形与建筑物提取及三维可视化[D].北京交通大学,2008.
[45]张兴华.基于图像识别的智能抄表系统研究与实现[D].哈尔滨理工大学,计算机应用技术,2012,硕士.
[46]杜景路.京津冀生态补偿法律问题研究[D].河北大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[47]刘学良.新疆西天山阿吾拉勒成矿带松湖铁矿成矿规律及找矿方向研究[D].新疆大学,地球探测与信息技术,2013,硕士.
[48]曾庆杰.母猪自动饲喂控制系统的设计与实现[D].南京农业大学,农业信息检测与控制技术,2012,硕士.
[49]秦刚.商业智能:管理信息化的新热点[J].金融经济,2005,16:59-60.
[50]胡飞飞.美国《1934年证券交易法》研究[D].安徽大学,法律史,2013,硕士.